取材與組織處理：無菌摘取新生鼠大腦皮質(zhì)，剝離軟腦膜與血管，用預冷 PBS 漂洗 3 次去除血污，剪碎至 1mm³ 組織塊，加入 0.25% 胰蛋白酶，37℃恒溫消化 15min，期間輕搖 2 次；消化終止后加入含 10% 胎牛血清的高糖 DMEM 培養(yǎng)基，用巴氏吸管反復吹打至單細胞懸液，200 目篩網(wǎng)過濾去除組織殘渣。

 

接種與初代培養(yǎng)：將過濾后的細胞懸液 1000r/min 離心 5min，棄上清后用完全培養(yǎng)基重懸，調(diào)整細胞密度至 1×10?個 /mL，接種于多聚賴氨酸包被的培養(yǎng)瓶中，置于 37℃、5% CO?飽和濕度培養(yǎng)箱；24h 首次換液，去除未貼壁的神經(jīng)元與細胞碎片，后續(xù)每 3d 換液 1 次，培養(yǎng) 7-10d 至細胞融合度達 90% 以上。

 

純化與傳代：將融合的混合膠質(zhì)細胞培養(yǎng)瓶置于 37℃恒溫搖床，180r/min 振搖 30min，去除貼壁較松的小膠質(zhì)細胞；棄上清后用 PBS 漂洗 2 次，加入 0.25% 胰酶消化 5min，吹打脫壁后離心重懸，按 1:2 比例傳代至新包被培養(yǎng)瓶，此為 P1 代星形膠質(zhì)細胞，繼續(xù)培養(yǎng) 3-5d 至融合。

 

成熟培養(yǎng)與鑒定：P1 代細胞融合后改為每 2d 換液 1 次，繼續(xù)培養(yǎng) 2-3 周至細胞成熟，成熟細胞呈典型 “鋪路石” 狀，胞體扁平多角形；取成熟細胞進行 GFAP 免疫熒光鑒定，4% 多聚甲醛固定 30min，一抗孵育過夜后熒光二抗孵育 1h，DAPI 染核，熒光顯微鏡下觀察，GFAP 陽性率≥95% 即為合格原代星形膠質(zhì)細胞。

 

常規(guī)維護與使用：成熟細胞可用于后續(xù)實驗，若需傳代培養(yǎng)建議不超過 P3 代，避免細胞表型丟失；實驗前 24h 換液 1 次，保證細胞活性，培養(yǎng)過程中密切觀察，及時清除污染或凋亡細胞。