本操作以乳鼠（1~3 日齡）關(guān)節(jié)軟骨為材料，采用酶消化法分離原代軟骨細(xì)胞，全程遵循無菌操作原則，操作時長約 3~4h，細(xì)胞得率和活性均較優(yōu)，步驟如下：
- 實驗前準(zhǔn)備：超凈工作臺紫外滅菌 30min，將 0.25% 胰蛋白酶、0.1%Ⅱ 型膠原酶置于 37℃水浴預(yù)熱；乳鼠經(jīng) 75% 乙醇全身浸泡消毒 5min，無菌條件下斷頭處死后，迅速取四肢關(guān)節(jié)（膝關(guān)節(jié)、髖關(guān)節(jié)為主），放入預(yù)冷的 PBS 緩沖液（含雙抗）中漂洗，去除皮毛、肌肉、韌帶等結(jié)締組織，僅保留乳白色透明軟骨組織。
- 軟骨組織剪碎：將純化后的軟骨組織轉(zhuǎn)移至無菌培養(yǎng)皿，用無菌眼科剪反復(fù)剪碎至 1mm³ 左右的勻漿狀，期間用 PBS 漂洗 2~3 次，棄去上清，去除殘留血細(xì)胞和組織碎屑。
- 分步酶解消化：向剪碎的軟骨組織中加入適量預(yù)熱的 0.25% 胰蛋白酶，37℃恒溫?fù)u床（100r/min）消化 30min，棄去胰酶（去除雜細(xì)胞）；加入 0.1%Ⅱ 型膠原酶，液面沒過組織即可，繼續(xù) 37℃恒溫?fù)u床（80~100r/min）消化 2~3h，期間輕搖培養(yǎng)瓶 2~3 次，至軟骨組織完全消散，形成渾濁的細(xì)胞懸液。
- 細(xì)胞過濾與離心：將消化后的細(xì)胞懸液通過 200 目無菌尼龍濾網(wǎng)過濾，去除未消化的組織殘渣；濾液移入無菌離心管，1000r/min 室溫離心 5min，棄去上清酶液，用含 10% 胎牛血清的 DMEM/F12 培養(yǎng)基重懸細(xì)胞沉淀，再次 1000r/min 離心 5min，洗滌 2 次。
- 細(xì)胞計數(shù)與接種：用適量完全培養(yǎng)基重懸最終細(xì)胞沉淀，取少量細(xì)胞懸液與臺盼藍(lán)染液 1:1 混合，顯微鏡下計數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度至 1×10?~2×10?個 /mL；將細(xì)胞懸液接種至培養(yǎng)瓶 / 皿，置于 37℃、5% CO?、飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
- 后續(xù)初培養(yǎng)處理：接種后 24h 內(nèi)不換液，讓細(xì)胞充分貼壁；24h 后首次換液，棄去未貼壁的死細(xì)胞和殘留雜質(zhì)，后續(xù)每 2~3 天換液一次，待細(xì)胞融合至 80%~90% 時，即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。
關(guān)鍵注意事項：酶解時間需嚴(yán)格把控，膠原酶消化過久會損傷細(xì)胞活性；全程操作輕柔，避免機械力破壞軟骨細(xì)胞；所有耗材均需無菌處理，PBS 和培養(yǎng)基全程預(yù)冷，減少細(xì)胞應(yīng)激。
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更新時間：2026-01-30
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